GB/T 23527.2-2025 酶(méi)製(zhì)劑質(zhì)量要(yào)求 第2部(bù)分：脂(zhī)肪(fáng)酶(méi)製劑(jì)

範(fàn)圍(wéi)
本文件(jiàn)給(gěi)出了脂肪(fáng)酶製劑的產(chǎn)品(pǐn)分(fēn)類(lèi)，規定了技(jì)術(shù)要求，檢驗(yàn)規則，標誌，包(bāo)裝(zhuāng)，運輸和(hé)貯(zhù)存，並描述(shù)了(liǎo)相應的試驗方(fāng)法(fǎ)。
本(běn)文(wén)件(jiàn)適(shì)用(yòng)於(yú)微生物發酵生(shēng)產的脂(zhī)肪酶(méi)製劑產(chǎn)品的生(shēng)產，檢(jiǎn)驗(yàn)和(hé)銷(xiāo)售(shòu)。

術(shù)語(yǔ)和定義(yì)
下(xià)列(liè)術語和定(dìng)義(yì)適(shì)用於(yú)本(běn)文件。
脂肪(fáng)酶  lipase
能水解(jiě)甘油(yóu)三酯(含(hán)天(tiān)然油脂(zhī))或脂肪(fáng)酸(suān)酯(zhǐ)產生(shēng)單或雙甘油酯或甘(gān)油和(hé)遊離(lí)脂肪酸(suān)，在特定條(tiáo)件下也能(néng)催(cuī)化酯(zhǐ)合成(chéng)和酯交(jiāo)換(huàn)反(fǎn)應(yīng)的(dí)酶(méi)。
脂(zhī)肪(fáng)酶製劑  lipase preparations
以(yǐ)脂(zhī)肪(fáng)酶為(wéi)主要(yào)催化活(huó)性(xìng)組分(fēn)，通(tōng)過製(zhì)劑(jì)等(děng)工(gōng)藝(yì)製得(dé)的產(chǎn)品。
注：製劑(jì)工藝(yì)中能加入有助(zhù)於(yú)產(chǎn)品貯(zhù)存(cún)，穩(wěn)定和使用的輔料(liào)。
脂肪酶活力  lipase activity
脂(zhī)肪酶(méi)製劑(jì)的酶(méi)活(huó)力  activity of lipase preparations
1g固體(tǐ)脂肪酶製(zhì)劑(或(huò)1mL液(yè)體脂肪酶製劑)含(hán)有的酶活力單(dān)位(wèi)。
注(zhù)1：以(yǐ)U/g(或(huò)U/mL)表示。
注2：在一定溫度和pH條件(jiàn)下，脂肪(fáng)酶每(měi)分鐘(zhōng)水解(jiě)底(dǐ)物產(chǎn)生(shēng)1μmol的可滴(dī)定(dìng)的脂(zhī)肪(fáng)酸(suān)，即(jí)為(wéi)脂肪酶(méi)1個酶活力單位(wèi)(以(yǐ)U表示(shì))。也能根據(jù)所(suǒ)采(cǎi)用的酶(méi)活(huó)力(lì)測定方法，另(lìng)行(háng)約(yuē)定(dìng)相應(yīng)的酶活力(lì)單(dān)位(wèi)。

產品(pǐn)分類(lèi)
按產品的應用領(lǐng)域
食品工業用(yòng)和其他工業用(yòng)脂肪(fáng)酶製(zhì)劑。
按產品的(dí)形(xíng)態
固(gù)體劑型(含粉末劑型(xíng)，顆粒(lì)劑(jì)型(xíng)和(hé)固(gù)定(dìng)化(huà)劑型)和(hé)液(yè)體劑(jì)型脂肪(fáng)酶製(zhì)劑(jì)。

要(yào)求(qiú)
感官(guān)要(yào)求(qiú)
應符合表1的規(guī)定(dìng)。


理化(huà)要求(qiú)
應符合(hé)表2的規定。


試驗方(fāng)法(fǎ)
酶(méi)活(huó)力
根(gēn)據底物適應性(xìng)，測(cè)定(dìng)水解橄欖油(yóu)底物的酶(méi)活(huó)力時，按附(fù)錄A進行(háng)檢測；測(cè)定水解(jiě)三丁酸(suān)甘(gān)油酯底(dǐ)物的酶活力時，可參考附(fù)錄B。也可根據實際需(xū)求采(cǎi)用其他方法(fǎ)進(jìn)行(háng)檢測(cè)。

附錄(lù)A  (規範性)
脂肪酶製(zhì)劑活(huó)力(lì)的(dí)測定滴(dī)定法
A.1 原理(lǐ)
脂肪酶(méi)在(zài)一定(dìng)條(tiáo)件下，能(néng)使甘(gān)油(yóu)三(sān)酯(zhǐ)水(shuǐ)解成(chéng)脂肪酸(suān)，甘(gān)油二酯，甘油單(dān)酯(zhǐ)和(hé)甘(gān)油，所釋(shì)放的(dí)脂(zhī)肪酸可(kě)用(yòng)標準鹼溶(róng)液進(jìn)行(háng)中和(hé)滴(dī)定，用pH計指示反(fǎn)應(yīng)終(zhōng)點，根據消耗(hào)的鹼(jiǎn)量，計算其(qí)酶(méi)活(huó)力(lì)。
反應(yīng)式為：

A.2 試劑(jì)和材料
A.2.1 聚乙烯醇：聚合度1750±50。
A.2.2 橄(gǎn)欖(lǎn)油(yóu)：試驗(yàn)試(shì)劑(jì)。
A.2.3 無水乙醇。
A.2.4 磷酸(suān)二氫(qīng)鉀(jiǎ)。
A.2.5 十(shí)二(èr)水(shuǐ)磷(lín)酸氫二鈉(nà)。
A.2.6 NaOH。
A.3 溶液(yè)配製(zhì)
A.3.1 聚(jù)乙烯(xī)醇溶(róng)液(yè)(4%)：稱取聚乙(yǐ)烯醇40g(精確至0.1g)，加水800mL，在沸(fèi)水浴(yù)中(zhōng)加熱，攪(jiǎo)拌(bàn)，直(zhí)至全(quán)部溶(róng)解(jiě)，冷(lěng)卻(què)定(dìng)容至1000mL。
注：根據乳化效(xiào)果(guǒ)和溶(róng)解(jiě)情(qíng)況(kuàng)，也能(néng)選(xuǎn)擇使用(yòng)2％的聚(jù)乙(yǐ)烯醇溶(róng)液。
A.3.2 底物(wù)溶(róng)液(yè)：稱(chēng)量聚乙烯醇(chún)溶液150g， 加(jiā)橄(gǎn)欖(lǎn)油(yóu)50g，用高(gāo)速匀漿(jiāng)機10000r/min處(chǔ)理(lǐ)6min(分2次處理(lǐ)，間隔(gé)5min，每(měi)次(cì)處理(lǐ)3min)，水(shuǐ)浴(yù)控(kòng)製溫(wēn)度(dù)，處理過(guò)程中(zhōng)溫度(dù)維持(chí)在(zài)60°C，處(chǔ)理(lǐ)結束後常溫下(xià)磁(cí)力(lì)攪拌(bàn)20min。底物溶液(yè)顯(xiǎn)微(wēi)鏡(jìng)觀(guān)察應(yīng)有(yǒu)80％以上(shàng)的液滴直徑小(xiǎo)於(yú)或等(děng)於3μm。該溶(róng)液(yè)現(xiàn)配現用。
注：也能(néng)選其他轉速(sù)，並根據(jù)乳化效(xiào)果(guǒ)延(yán)長(cháng)或縮(suō)短(duǎn)均質時間(jiān)。
A.3.3 磷酸緩(huǎn)衝(chōng)溶(róng)液(pH=7.5)：分別稱取磷酸(suān)二(èr)氫(qīng)鉀1.96g和十二水磷(lín)酸氫二(èr)鈉39.62g，用水溶解並(bìng)定(dìng)容(róng)至500mL。如(rú)需要(yào)，調(tiáo)節溶液的(dí)pH至7.5±0.05。
A.3.4 NaoH標(biāo)準溶(róng)液(yè)[c(NaOH)=0.05mol/L上(shàng)按 GB/T 601 的規定配製(zhì)與標(biāo)定(dìng)0.5mol/L NaOH標(biāo)準滴(dī)定(dìng)溶液(yè)。使用(yòng)時(shí)，準(zhǔn)確(què)稀(xī)釋(shì)10倍。
注：也(yě)能(néng)采(cǎi)用(yòng)商品(pǐn)化(huà)的NaOH標準(zhǔn)溶(róng)液。
A.3.5 乙醇溶液(95%，體(tǐ)積(jī)分數(shù))。
A.3.6 酚酞指示液(10g/L)：按 GB/T 603 的規定(dìng)配(pèi)製。
A.4 儀(yí)器和(hé)設(shè)備
A.4.1 磁力(lì)攪拌水(shuǐ)浴鍋(guō)：±0.2°C。
A.4.2 電(diàn)子天平：感(gǎn)量(liáng)0.1mg。
A.4.3 移(yí)液器。
A.4.4 酸(suān)度計：精度±0.01。
A.4.5 秒(miǎo)表(biǎo)。
A.4.6 高速(sù)匀(yún)漿(jiāng)機(jī)。
A.4.7 電位(wèi)滴定儀。
A.4.8 光(guāng)學(xué)顯(xiǎn)微(wēi)鏡。
A.4.9 微(wēi)量(liáng)滴(dī)定管：10mL，分刻度≤0.05mL。
A.5 分析(xī)步驟
A.5.1 樣品前(qián)處(chǔ)理
稱(chēng)取酶樣品1.00g(精確至(zhì)0.1mg)或(huò)1.0mL，加入(rù)適(shì)量磷酸緩(huǎn)衝溶(róng)液磁(cí)力攪(jiǎo)拌溶解15min並稀釋(shì)，稀釋酶(méi)液(yè)采(cǎi)用玻璃(lí)器(qì)皿(mǐn)，測(cè)定時控(kòng)製酶液濃度，樣(yàng)品與對(duì)照消(xiāo)耗(hào)鹼(jiǎn)量之差(chà)控製在(zài)1.0mL~2.0mL範(fàn)圍(wéi)內(nèi)，吸取樣品(pǐn)時，應將酶(méi)液搖匀(yún)後(hòu)再取。
注：酶(méi)會(huì)附著在塑料(liào)上(shàng)，因(yīn)此(cǐ)用(yòng)玻璃器(qì)皿溶解稀釋(shì)和滴定。使用塑料槍頭(tóu)短(duǎn)時間轉(zhuǎn)移的情況(kuàng)除(chú)外(wài)。
A.5.2 測定(dìng)
A.5.2.1 電(diàn)位滴定(dìng)法(fǎ)(仲裁(cái)法(fǎ))
按電位滴定(dìng)儀使(shǐ)用(yòng)說(shuō)明書(shū)對儀(yí)器(qì)進(jìn)行校(xiào)正(若使(shǐ)用(yòng)酸度(dù)計進(jìn)行(háng)試(shì)驗(yàn)， 則(zé)按(àn)照酸(suān)度(dù)計說(shuō)明書對(duì)酸度計進行校正(zhèng))。
取(qǔ)4個(gè)100mL燒杯，於空白(bái)杯(bēi)(A)和樣品杯(bēi)(B1，B2，B3)中(zhōng)各(gè)加(jiā)入4.0mL底物溶液，5.0mL磷酸(suān)緩(huǎn)衝溶液，再於A杯(bēi)中加(jiā)入(rù)15.00mL 95％乙醇溶液。40°C±0.2°C水(shuǐ)浴中(zhōng)磁力攪拌預熱5min，然(rán)後於(yú)空(kōng)白(bái)杯(A)和(hé)樣品杯(B1，B2，B3)中各加1.00mL待(dài)測酶液，準確(què)反應(yīng)15min後，於樣品杯(bēi)(B1，B2，B3)中立即補加15.00mL 95％乙(yǐ)醇溶液終(zhōng)止(zhǐ)反應。
在(zài)每個(gè)燒杯中加25mL蒸餾水(shuǐ)，置於電(diàn)位滴(dī)定(dìng)儀(yí)上(shàng)(若使用酸(suān)度(dù)計(jì)，則將(jiāng)酸(suān)度計電極放入燒杯中)，邊(biān)攪拌，邊(biān)用NOH標(biāo)準溶液滴(dī)定，直至pH10.3為滴(dī)定終(zhōng)點(diǎn)，記(jì)錄消耗NOH標(biāo)準溶液(yè)的體(tǐ)積。
注(zhù)：對(duì)於某些(xiē)脂(zhī)肪酶(méi)樣(yàng)品加入25mL蒸餾(liù)水影響(xiǎng)酶活(huó)檢測結(jié)果，此類(lèi)樣品在(zài)終止(zhǐ)反(fǎn)應後(hòu)直(zhí)接(jiē)進行NaOH標準溶液滴定。
A.5.2.2 指示劑(jì)滴定法(fǎ)
取2個100mL錐形(xíng)瓶(píng)，分別於空白(bái)瓶(A)和樣(yàng)品瓶(B)中(zhōng)各(gè)加入底物溶(róng)液(yè)4.00mL和磷酸(suān)緩衝(chōng)液5.00mL，再於(yú)A瓶中(zhōng)加(jiā)入95％乙(yǐ)醇(chún)溶液(yè)15.00mL，於(yú)40°C±0.2°C水(shuǐ)浴中預熱(rè)5min，然後(hòu)於(yú)空(kōng)白(bái)瓶(A)，樣(yàng)品瓶(píng)(B)中各加待測酶液(yè)1.00mL，立即混匀計時，準(zhǔn)確反(fǎn)應15min後，於樣(yàng)品瓶(B)中立即補加95％乙(yǐ)醇溶液15.0mL終止(zhǐ)反應(yīng)，取(qǔ)出。
於(yú)空(kōng)白和(hé)樣(yàng)品溶液中各加(jiā)酚酞指(zhǐ)示液兩(liǎng)滴，用NOH標準溶液滴(dī)定(dìng)，直(zhí)至微紅(hóng)色並保(bǎo)持(chí)30s不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消(xiāo)耗(hào)NaoH標準溶液的(dí)體(tǐ)積。
A.6 計算(suàn)
脂肪(fáng)酶製(zhì)劑的(dí)酶活力按(àn)公(gōng)式(shì)(A .1)計算(suàn)：

式(shì)中：
X₁——樣品(pǐn)的酶活(huó)力(lì)，單(dān)位為(wéi)酶(méi)活力單(dān)位每克(kè)或(huò)酶活力單位每毫(háo)升(U/g或U/mL)；
V₁——滴定樣品(pǐn)溶液(yè)時(shí)消耗NaOH標(biāo)準溶液(yè)的體積，單(dān)位為毫(háo)升(mL)；
V₂——滴(dī)定空白溶(róng)液時消(xiāo)耗NaoH標(biāo)準溶(róng)液的體積(jī)，單位(wèi)為(wéi)毫(háo)升(mL)；
c ——NaOH標(biāo)準溶液濃度，單(dān)位為摩爾每升(mol/L)；
50——0.05mol/L NaOH溶液1.00mL相(xiāng)當於脂(zhī)肪酸50μmol；
n₁——樣品(pǐn)的稀釋倍(bèi)數(shù)；
0.05——NaOH標(biāo)準溶液(yè)濃度換算係(xì)數(shù)；
15——反應時(shí)間15min。
A.7 結(jié)果(guǒ)表(biǎo)示(shì)
所得結果表示(shì)至整數(shù)。
A.8 精(jīng)密度
在重(zhòng)復(fù)性(xìng)條件(jiàn)下獲得的(dí)兩次獨(dú)立測定結果的差值應不超過算術平均(jūn)值的10%。

附錄(lù)B  (資料性)
脂(zhī)肪酶(méi)製(zhì)劑活力的(dí)測定動態(tài)滴(dī)定法
B.1 方法(fǎ)信(xìn)息
B.1.1 原理
脂肪酶水(shuǐ)解甘(gān)油三酯(zhǐ)生(shēng)成(chéng)脂(zhī)肪(fáng)酸(suān)，使反應(yīng)體係的pH下(xià)降。通(tōng)過連(lián)續加入(rù)鹼的(dí)方法(fǎ)保(bǎo)持(chí)反應體係的pH恒(héng)定。鹼滴定(dìng)的速率與酶活力(lì)成(chéng)比例。酯酶的(dí)存在(zài)會(huì)使(shǐ)檢測的脂(zhī)肪酶(méi)的(dí)活(huó)力(lì)增(zēng)加。蛋白酶(méi)的(dí)存(cún)在降解脂肪(fáng)酶，從(cóng)而使檢測到的(dí)脂肪酶(méi)的(dí)活力(lì)減(jiǎn)小。
注(zhù)：洗滌劑(jì)的(dí)存在會(huì)嚴(yán)重(zhòng)影(yǐng)響本方法(fǎ)。依不同洗(xǐ)滌(dí)劑的類(lèi)型和濃度(dù)不同(tóng)，這(zhè)種影響表(biǎo)現(xiàn)為從(cóng)抑(yì)製到(dào)激活。酶(méi)會附(fù)著在塑料上(shàng)，因(yīn)此(cǐ)用(yòng)玻璃(lí)器(qì)皿(mǐn)溶(róng)解稀釋和滴定(dìng)，使(shǐ)用塑料(liào)槍頭(tóu)短時間轉移(yí)的情況(kuàng)除外。
B.1.2 反應(yīng)式
反應式(shì)為：

B.1.3 反(fǎn)應(yīng)條(tiáo)件(jiàn)
反應(yīng)條(tiáo)件如下：
——溫(wēn)度：30°C±1°C；
——pH：7.00；
——底(dǐ)物(wù)濃度：0.16mol/L的三(sān)丁酸甘油酯；
——反(fǎn)應時(shí)間(jiān)：至少(shǎo)1.5min(隻有綫性反應(yīng)區(qū)用於(yú)計(jì)算(suàn)斜(xié)率(shuài))。
B.1.4 分析範(fàn)圍(wéi)
樣品的分(fēn)析範(fàn)圍(wéi)為(wéi)0.2U/mL~4.0U/mL。如(rú)果(guǒ)可能，所(suǒ)有樣品(pǐn)在1.5U/mL~4.0U/mL的範(fàn)圍內被(bèi)分析(xī)。
B.1.5 檢(jiǎn)測(cè)限(xiàn)
對於液(yè)體樣品(pǐn)，檢測限為(wéi)20U/g，相當(dāng)於2.5g樣(yàng)品(pǐn)溶解(jiě)在10mL溶液(yè)中，然後(hòu)再(zài)稀釋25倍。對(duì)於固體樣品(pǐn)，檢(jiǎn)測限(xiàn)為50U/g，相(xiāng)當於1.0g樣品(pǐn)溶(róng)解(jiě)在(zài)10mL溶(róng)液(yè)中(zhōng)，然後(hòu)再稀釋25倍。
B.2 儀(yí)器和設備
B.2.1 動(dòng)態滴定(dìng)(pH-stat)功(gōng)能的滴定儀(yí)。
B.2.2 乳化(huà)器。
B.2.3 恒(héng)溫水浴：精度±0.2°C。
B.2.4 溫(wēn)度(dù)計(jì)：精度(dù)±0.2°C。
B.2.5 自(zì)動(dòng)移(yí)液器(qì)。
B.3 試劑
除(chú)非另有(yǒu)說明(míng)，在(zài)分析(xī)中(zhōng)僅(jǐn)使用(yòng)確認(rèn)為(wéi)分析純的試(shì)劑和蒸餾水或去(qù)離(lí)子水或(huò)相當(dāng)純(chún)度的(dí)水(shuǐ)。
B.3.1 三(sān)丁(dīng)酸甘(gān)油(yóu)酯(zhǐ)(C₁₅H₂₆O₆)。
B.3.2 氯化(huà)鈉(NaCl)。
B.3.3 磷酸二(èr)氫(qīng)鉀(KH₂PO₄)。
B.3.4 阿(ā)拉伯膠(jiāo)。
B.3.5 甘(gān)氨酸(suān)(H₂NCH₂COOH)。
B.3.6 甘(gān)油(yóu)[HOCH₂CHCOH)CH₂OH]。
B.3.7 NaOH片劑(jì)(NaOH)。
B.3.8 電極校正液(pH7.0)。
B.3.9 電(diàn)極校(xiào)正液(pH4.01)。
B.3.10 乙醇溶(róng)液(96%，體(tǐ)積(jī)分(fēn)數)。
B.3.11 氮氣(N₂)。
B.3.12 NaOH溶(róng)液(yè)[c(NaOH)=1mol/L]：按(àn)照(zhào) GB/T 601 的規定(dìng)配製。
B.3.13 NaOH滴(dī)定液[c(NaOH)=0.025mol/L]：取NaOH溶(róng)液25mL，用水稀(xī)釋(shì)並(bìng)定容至1000mL。配(pèi)好(hǎo)後(hòu)需(xū)用適宜的設備(bèi)脫氣(qì)。
B.3.14 NaOH滴定液(yè)[c(NaOH)=0.005mol/L上(shàng)取NaOH滴定(dìng)液(yè)25mL，用水稀(xī)釋並(bìng)定(dìng)容(róng)至5000mL。
B.3.15 乳化(huà)劑：移(yí)取(qǔ)約180mL去離(lí)子(zǐ)水於500mL燒杯中，加(jiā)入攪拌(bàn)子高速攪拌(bàn)，再緩慢(màn)加(jiā)入30.0g阿(ā)拉伯膠，繼(jì)續(xù)攪拌(bàn)至全(quán)部(bù)溶解。另(lìng)取500mL燒杯，加入53.7g氯(lǜ)化(huà)鈉和1.20g磷(lín)酸(suān)二氫鉀(jiǎ)，再加入350mL水充分溶(róng)解(jiě)。將1620mL甘(gān)油(yóu)置於3L容(róng)量瓶中，再依(yī)次加入上(shàng)述氯化(huà)鈉(nà)-磷酸二氫鉀溶液(yè)和(hé)阿拉(lā)伯(bó)膠溶液，最(zuì)後以(yǐ)水定容並(bìng)混匀(yún)。
B.3.16 底(dǐ)物乳劑(jì)：稱取三丁(dīng)酸(suān)甘油酯62.5g，分別量(liáng)取乳化(huà)劑(jì)200mL和水940mL，混(hùn)合。將混合液(yè)用匀(yún)漿(jiāng)器處(chǔ)理3min(7000r/min)。匀(yún)漿後(hòu)的(dí)溶(róng)液先(xiān)用普(pǔ)通的(dí)磁(cí)力攪拌器(qì)攪(jiǎo)拌(bàn)至(zhì)少20min，然後(hòu)調節pH至4.75±0.05。
注：不同來源(yuán)和批(pī)號的三丁酸(suān)甘油酯和阿(ā)拉(lā)伯(bó)膠對試(shì)驗結果有(yǒu)影響，在(zài)更(gēng)換(huàn)產(chǎn)品或批(pī)號(hào)前需進行有效性確認。
B.3.17 甘氨酸(suān)緩(huǎn)衝液(yè)1(7.51g/L)：稱(chēng)取(qǔ)甘氨酸37.54g和(hé)NaOH片劑18.5g，用(yòng)水溶解(jiě)並(bìng)定容至(zhì)5L。如(rú)需要，調(tiáo)節(jié)溶液(yè)的pH至10.8±0.05。
B.3.18 甘氨酸緩(huǎn)衝液(yè)2(0.75g/L)：取100mL甘氨(ān)酸緩(huǎn)衝(chōng)液1，用水定容(róng)至(zhì)1000mL。如(rú)需(xū)要，調節溶(róng)液的(dí)pH至10.8±0.05。
B.4 標準曲綫和樣品(pǐn)處(chǔ)理
B.4.1 標準曲綫
稱取一定量的(dí)已(yǐ)知(zhī)活(huó)力酶(méi)標(biāo)準品(pǐn)，精(jīng)確(què)至(zhì)0.0001g，用(yòng)甘氨酸(suān)緩衝(chōng)液2溶解(jiě)並(bìng)稀釋(shì)，製成(chéng)標(biāo)準儲備(bèi)液(yè)。標準儲備液(yè)的濃度(dù)為20U/mL。然後按照(zhào)表B.1配製溶(róng)液(yè)，並(bìng)繪製標準曲(qū)綫。

B.4.2 標(biāo)準對照
可使(shǐ)用(yòng)已(yǐ)知活力的(dí)樣(yàng)品作為標(biāo)準(zhǔn)對照。標準對照的處理(lǐ)同(tóng)樣(yàng)品。
B.4.3 樣(yàng)品處(chǔ)理
不同的(dí)樣品(pǐn)需做(zuò)不同的(dí)預(yù)處(chǔ)理，以激活或(huò)保護(hù)在樣品(pǐn)基(jī)質(zhì)中(zhōng)的(dí)脂(zhī)肪酶(méi)。
可考慮(lǜ)采(cǎi)用甘(gān)氨(ān)酸(suān)緩衝(chōng)液(yè)1和(hé)水(shuǐ)來分(fēn)別(bié)溶(róng)解和稀釋樣(yàng)品的(dí)方(fāng)法(fǎ)，或采用甘氨酸緩衝液2來(lái)溶解(jiě)和稀釋(shì)樣(yàng)品的方(fāng)法，或直接用水(shuǐ)溶(róng)解和(hé)稀釋樣(yàng)品的(dí)方法，以求(qiú)得到效(xiào)果(guǒ)。樣(yàng)品(pǐn)的溶解液和稀釋(shì)液需攪(jiǎo)拌均(jūn)匀。樣品最(zuì)終稀(xī)釋到(dào)酶(méi)活(huó)力(lì)在1.5U/mL~ 4.0U/mL範圍內(nèi)。如可(kě)能，樣品(pǐn)稀(xī)釋完(wán)立即測(cè)定(dìng)。
B.5 分析步(bù)驟
B.5.1 係統(tǒng)準(zhǔn)備
B.5.1.1 按照無(wú)水乙(yǐ)醇，適(shì)當(dāng)的(dí)肥皂水(shuǐ)，熱(rè)水(shuǐ)，去(qù)離子(zǐ)水(shuǐ)，底(dǐ)物的順序(xù)清(qīng)洗(xǐ)滴定(dìng)容器和管路。保證水(shuǐ)浴的溫度(dù)在(zài)30.0°C±0.5°C。
B.5.1.2 校正(zhèng)pH電極：使用(yòng)前需校正(zhèng)pH電(diàn)極的靈敏(mǐn)度在(zài)95%~102%；pH7.00在(zài)6.985~6.989之間；pH4.01在4.009~4.012之間。如(rú)果(guǒ)達(dá)不(bù)到此標(biāo)準，按照pH電(diàn)極(jí)使(shǐ)用(yòng)說明(míng)進(jìn)行衝洗(xǐ)並再次(cì)校正。
B.5.2 分(fēn)析(xī)
B.5.2.1 pH 電極(jí)用後浸泡(pào)在飽和(hé)的KCl溶液(yè)中，使用前衝洗。在(zài)反(fǎn)應溶液(yè)表(biǎo)麵用氮(dàn)氣吹(chuī)充(chōng)，以(yǐ)防止空(kōng)氣(qì)中二氧(yǎng)化碳(tàn)的幹擾。分析前一(yī)定(dìng)要(yào)保(bǎo)證(zhèng)底物的(dí)溫度為(wéi)30.0°C±0.5°C。在分析(xī)每個樣(yàng)品前(qián)要(yào)用0.005mol/L的NaOH滴(dī)定(dìng)液(yè)衝(chōng)洗滴定(dìng)皿(mǐn)和管路(lù)。
B.5.2.2 試(shì)驗(yàn)步驟如下。
——將15mL的底(dǐ)物加(jiā)入滴定(dìng)皿(mǐn)中。滴(dī)定(dìng)前(qián)pH電(diàn)極的讀(dú)數應(yīng)小(xiǎo)於(yú)7.0。
——加1mL樣品稀(xī)釋液(yè)加入滴(dī)定(dìng)皿(mǐn)中(zhōng)。反(fǎn)應(yīng)體係的pH在(zài)滴(dī)定過(guò)程中保持在(zài)7.0。記(jì)錄為(wéi)保持恒(héng)定pH而(ér)加(jiā)入的滴定液(yè)的量。
——滴定結束後滴定(dìng)儀打印出滴(dī)定曲(qū)綫(xiàn)綫性(xìng)範圍的(dí)平均斜率(shuài)(如果使用不同的(dí)設備，數據可能(néng)以其(qí)他形式(shì)輸出(chū))。滴定(dìng)曲綫需有一段(duàn)持續1.5min的綫(xiàn)性(xìng)輸出(chū)。
——先(xiān)分(fēn)析標準(zhǔn)曲綫(xiàn)(每(měi)個標(biāo)準點分析一次)，再分(fēn)析一(yī)個標(biāo)準對(duì)照，最(zuì)後分析(xī)樣品(每個(gè)樣品分(fēn)析一次(cì))。需注(zhù)意(yì)， 一天(tiān)內非一次運行的樣品(pǐn)不(bù)能使用(yòng)相同(tóng)的標準曲綫。如(rú)果樣(yàng)品(pǐn)在當(dāng)天(tiān)晚些(xiē)時(shí)候分析，標準(zhǔn)溶(róng)液要重(zhòng)新分(fēn)析(xī)。
——每個樣(yàng)品分(fēn)析前和(hé)後(hòu)一(yī)個樣(yàng)品(pǐn)完成分析(xī)後，係統將進(jìn)行衝(chōng)洗。排(pái)空底(dǐ)物容(róng)器和(hé)管路，並用(yòng)乙(yǐ)醇(chún)衝洗。如果(guǒ)係(xì)統將(jiāng)在(zài)一周(zhōu)以上(shàng)時(shí)間不再(zài)使(shǐ)用(yòng)，則(zé)需(xū)用去(qù)離(lí)子水進(jìn)行衝洗(xǐ)並(bìng)用NaOH滴定(dìng)液(yè)或相同濃度(dù)的(dí)鹽酸溶液(yè)充滿敏感部(bù)件，避(bì)免出現鹽類結(jié)晶。
B.6 計(jì)算
B.6.1 結果(guǒ)計算(suàn)
利(lì)用標(biāo)準點的測定值(zhí)作標準曲(qū)綫，其(qí)中(zhōng)X軸為(wéi)標準品(pǐn)酶(méi)活(huó)力(lì)，Y軸(zhóu)為(wéi)相(xiāng)應的滴(dī)定(dìng)反應的(dí)平均斜(xié)率(mL/min)。標準曲(qū)綫為(wéi)一(yī)條直(zhí)綫。樣(yàng)品(pǐn)稀釋液(yè)的活(huó)力從標(biāo)準(zhǔn)曲綫(xiàn)中(zhōng)讀(dú)出，然後(hòu)按公式(shì)(B.1)計(jì)算(suàn)：

式(shì)中(zhōng)：
X₂——樣品(pǐn)的酶活力(lì)，單位為酶活力單(dān)位每克(U/g)或酶活力單位(wèi)每(měi)毫(háo)升(shēng)(U/mL)；
A ——稀釋(shì)樣(yàng)品在標(biāo)準曲綫上(shàng)讀(dú)出的酶(méi)活力，單(dān)位(wèi)為(wéi)酶活(huó)力單(dān)位(wèi)每毫(háo)升(U/mL)；
V₃——樣品溶解用的(dí)容(róng)量(liáng)瓶體積(jī)，單位為毫升(mL)；
n₂——第(dì)二次稀釋(shì)的(dí)倍(bèi)數；
m₃——樣品(pǐn)的質量或體積，單位(wèi)為克(g)或毫(háo)升(shēng)(mL)。
B.6.2 結果的確(què)認
當(dāng)滿足以(yǐ)下條件(jiàn)時可以確認(rèn)本(běn)次(cì)分析有(yǒu)效。
a) 標(biāo)準對照的檢(jiǎn)測(cè)值在(zài)本(běn)方(fāng)法(fǎ)所規定的可接受偏(piān)差範(fàn)圍內(nèi)。
b) 標(biāo)準曲綫(xiàn)的(dí)斜率(shuài)滿足：
1) 標準(zhǔn)點1小(xiǎo)於0.02mL/min；
2) 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)6在0.14mL/min~0.18mL/min之(zhī)間。
c) 標準曲(qū)綫(xiàn)的(dí)相(xiāng)關(guān)係(xì)數(r²)大(dà)於或等於(yú)0.995。
d) 標(biāo)準(zhǔn)點3～點6相(xiāng)關係數(shù)(r²)大(dà)於(yú)0.9995。標準(zhǔn)點(diǎn)1～點2的r²大於0.995是(shì)可接受的。如果(guǒ)達(dá)不到此條件(jiàn)，檢(jiǎn)查分(fēn)析係統(tǒng)。
B.6.3 結果的表(biǎo)示(shì)
結果(guǒ)給出(chū)3位(wèi)有(yǒu)效數字(zì)。如果結(jié)果(guǒ)低於檢(jiǎn)測限，則表示為(wéi)小(xiǎo)於(yú)20U/g(液體)或小於50U/g(固體)。
B.7 精密(mì)度(dù)
在重復性條(tiáo)件(jiàn)下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結果的差值(zhí)應(yīng)不超過算術平均值的(dí)5%。